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国家工商行政管理总局关于非法收购鲜茧行为定性处罚问题的答复

作者:法律资料网 时间:2024-07-26 02:46:06  浏览:9658   来源:法律资料网
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国家工商行政管理总局关于非法收购鲜茧行为定性处罚问题的答复

国家工商行政管理总局


国家工商行政管理总局

关于非法收购鲜茧行为定性处罚问题的答复

工商市字[2002]第202号

 
湖北省工商行政管理局:

你局《关于对无照、无证非法收购经营鲜茧行为定性处罚问题的请示》(鄂工商公字[2002]63号)收悉。经研究,答复如下:

工商行政管理机关对查处的非法收购经营鲜茧的行为,其违法行为发生在《茧丝流通管理办法》颁布实施之前的,可依据原《蚕茧价格和流通管理办法》的有关规定,予以定性处罚;其违法行为发生在《茧丝流通管理办法》颁布实施之后的,应按照《茧丝流通管理办法》的有关规定,予以定性处罚。

未取得鲜茧收购资格、未经登记注册的单位和个人从事鲜茧收购活动的,构成了《投机倒把行政处罚暂行条例》第三条第一款第十一项“其他扰乱社会主义市场经济秩序的投机倒把行为”,应依法进行查处。

二OO二年八月十六日

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驰名商标如何实现中国造

驰名商标如何实现中国造


  我国商标注册总量已经是世界第一位,我国已经成为世界的工厂,产品几乎遍布世界每个角落,有近两百个产品产量世界第一,有些产品的产量甚至占到世界的一半以上,但是在世界100个最有价值商标的榜上没有一个中国的商标(品牌,以下商标和品牌混同一个概念)。要实现世界驰名商标中国造,我们需要深层次的思考。

一、驰名商标需要消费者认可

  1999年保护工业产权巴黎公约和世界知识产权组织大会通过的《驰名商标保护规定的建议和注释》第二项(b)款规定,“如果某一商标被确定至少为某成员国中的一部分相关公众所熟知,该商标即应被该成员国认定为驰名商标”;(c)款规定“如果某一商标被确定至少为某成员国中的一部分相关公众所知晓,该商标可以被该成员国认定为驰名商标”我国《驰名商标认定和保护规定》的定义:驰名商标是指在中国为相关公众广为知晓并享有较高声誉的商标。按我国的定义,驰名商标只要满足两个条件:1、为相关公众所知晓,2、享有较高声誉,可见驰名商标并不神秘。当然本文讨论的不是法律定义的驰名商标,而是在世界上认可度很高的商标。
  很多世界著名的大名牌实都在中国加工生产,同一个工厂用同样的加工工艺和相同材质的原材料生产加工的衬衫,如果不贴任何商标,只能挣取微薄的加工费;如果贴上国内无名的商标,能卖几十块钱;如果贴上国内知名的商标可以卖到几百元,如果贴上“阿玛尼”这样世界顶级的商标,就可以卖到几千元,因为商标的不同价格可以相差几十倍。据测算,消费者每花费100元购买品牌商品,30元购买的是产品,70元则在为商标“买单”。消费者为什么愿意为驰名商标支付这么高的溢价,是因为是驰名商标的认可与信赖。
  我国早期的驰名商标是媒体评选的,后来由国家工商管理机关通过行政手段进行认定,法院在商标诉讼案件中也可以认定某商标为驰名商标。无论是工商管理机关还是法院评定驰名商标,其依据主要是看产品的销售额、纳税情况、广告宣传的费用等,基本不考虑消费者的意见。造成很多被认定的驰名商标消费者的认知度并不高,反而不如媒体的评选,多少会有一些消费者的意见。据统计消费者对同一个行业的商标一般只能记住前7个,再多的商标就很难形成强烈的印象。消费者购买商品能不能记住这个商标,对某个商标产生信赖进而产生一定的忠诚度,不会看这个商标是不是被认定为驰名商标,而是产品本身。事实上国外很多大品牌没有被认定为驰名商标,而消费者仍然趋之若鹜,买不起真品,甚至对假冒的都愿意去购买。因此驰名商标不是可以被评选出来的,也不是由政府或者司法机关来认定的,只有被消费者认可的商标才会被消费者青睐。对于驰名商标而言仅仅有认可度远远还是不够,仅仅说明消费者接受了这个商标,笔者认为只有消费者认定该商标,以购买该商标的产品为首选,甚至非此商标的产品就不买,消费者产生了忠诚度的商标才可以称为真正的“驰名商标”,要成为国际驰名商标则要使国际市场的消费者产生忠诚度。

二、打造驰名商标基本要素

  打造一个让世界消费者普遍认可的世界知名的驰名商标必须具备一些基本的要素:
  第一个要素是产品销售范围应当要广并占据一定的市场份额。无论是大众产品,还是只针对特殊群体的小众产品,销售的范围越广、市场份额越高,越容易在相关的消费者中产生知名度,一个商标在一个地方广告做得再大,如果没有产品的跟进,消费者很快就会遗忘,该商标不可能给消费者产生任何良好的印象。青岛啤酒曾经有个产品叫“大优”,当初在北京的广告做得很不错,但是笔者在北京的餐馆从来就没有喝到过,那么“大优”是什么味道?那么笔者对“大优”连基本的认知度都没有怎么可能产生认可,又怎么可能对“大优”产生忠诚度呢?
  日本丰田汽车公司的广告是“有路就有丰田车”,这是因为丰田的产品遍及世界,世界才会知道“丰田”这个驰名商标。我国是制造大国,销售到世界各地的产品却主要以加工贸易形式出口,并没有使用我国哪个企业的商标,这里有个重要原因,我国加工企业分散,各自为战,这样在进行加工贸易时,缺乏谈判的对价,国外企业进口我国产品基本不同意使用我国的商标。尽管我们生产加工的产品遍及世界每一个角落,但有几家企业可以将贴有自己商标的产品买到国际市场?我国企业走出去的本来就很少,据商务部统计,我国走出去的企业大多数是国有大型企业,进入是基本是资源性领域。我国缺少实力雄厚的大型企业有能力将自己的品牌产品大量卖到国外去。这几个因素决定了缺乏打造国际驰名商标的先觉条件——产品大量进入国际市场并占据一定的市场份额。
  2003年有关机构对国内27个行业的调查显示,有11个行业洋品牌居于领先地位,而在多数行业中我国品牌的竞争力早在五六年前就已经超过外国品牌,这主要归功于我国本土品牌的市场占有已经大大超过洋品牌。我们要打造世界知名的驰名商标,第一个要素是要有大型企业将带有自己商标的产品卖到世界主要市场,并且占据一定的市场份额。
  第二个要素商标必须要有内涵。商标最基本的功能是区别功能,区分产品或者服务的提供者,同时商标又可以成为一个载体,承载产品或服务的质量、信誉等多方面的信息,在消费者和企业之间架起信息交流的通道,由此可以降低消费者购买过程中信息成本,降低市场信息不对称程度,也由此在消费者心中烙上驰名的印记。而我们的企业对驰名商标的认识存在误区,只关注知名度,高价聘请策划公司,花费巨额广告费实际只在做一件事情,就是提高商标的知名度。没有内核的空心驰名商标,非常容易破灭,找找以前驰名商标“秦池”、“爱多”、“红桃K”、“三株”……这些曾经如雷贯耳的商标,没有自己的商标内核,一个个销声匿迹了。来自瑞典小镇的诺基亚公司进入通讯行业时间并不长,诺基亚“以科技以人为本”作为其商标核心内核打败了曾经只能仰视的行业的老大“摩托罗拉”。
  产品最基本是的内涵是质量,国际驰名的商标更需要良好的质量支撑。知名度高的产品只能吸引消费者的第一次购买,只有其产品本身以及服务的质量在消费者心中形成一定的美誉度,才可以吸引消费者的再次购买,使消费者对该品牌产生忠诚度。成熟的消费者其购买行为是非常理性的,他们不大理会广告的喧嚣,而是注重品牌所承载的各种信息,这些信息最为基本的是产品质量。所以打造国际驰名商标的首要问题就是提升产品内在质量,提高产品的美誉度,形成一批忠实的消费者群体。
  产品的第二个内涵要有创新,没有那个企业可以依靠一成不变的产品获得消费者永久的青睐。质量很容易被人超越,而且当产品质量达到一致时,竞争就会被同质化,价格战难免。诺基亚依靠持续的创新打败了老牌的“摩托罗拉”,要打造国际驰名商标必须要不断创新,笔者提出“以创新提升品牌的价值”。品牌和创新看似不相干,但是创新能赋予品牌独特的内涵,这内涵能迅速抓住消费者,能使品牌迅速成名,并使品牌价值保持持久的增长。一把小小的“吉列”剃须刀其利润是我国一台电视机的五六倍,吉列在创新上做足了功夫,一款剃须刀就申请了22项发明专利,其专利申请还覆盖到剃须刀手柄以及其他产品特色,甚至包括了产品的包装盒,这种盒子撕开时的响声和手感都让人体会一种恰到好处的阳刚之美。海尔彩电一改以前开关机时形成的瞬间闪烁射线,开发了“拉幕式开关机”屏显专利技术,使开关彩电像开启舞台帷幕一样逐渐打开或者关闭,对消费者的视觉伤害几乎减小到零,这一点小小的创新,立刻受到消费者的欢迎,使销量直线上升,媒体惊呼“海尔彩电奇迹”。要保持国际驰名商标的永久活力,创新必不可少。
  第三个要素是要有责任心。可以说任何产品都会发生产品质量问题,关键是看企业如何去处理?采取什么态度去处理?在三聚氰胺毒奶粉事件发生之前几个月三鹿公司已经接到报告,得知很多小孩喝了“三鹿”奶粉得了结石,也知道问题出在那里,但是三鹿公司采取的是隐瞒的做法。这种对消费者极端不负责的态度最终也被消费者所抛弃,这家曾经是行业前三甲的大型企业逃脱不了破产的命运。南京的“冠生园”使用陈年的月饼陷坑害消费者,被消费者抛弃,直接导致该公司的破产。当产品出了质量问题被曝光时,国内的公司首先想到的是通过公关公司去删除网络上不利的消息,去疏通政府关系,而不是召回产品,勇敢地向消费者承认错误。蒙牛在毒奶粉事件发生后也被检出含三聚氰胺,蒙牛的老总提出“大品牌要承担大责任”,就这种对消费者负责任的态度使蒙牛走出了三聚氰胺事件的阴霾。一个商标不管是多么的驰名,对消费者没有责任心必然被消费者抛弃。因而打造国际驰名商标必须要有对消费者的责任心。

三、打造驰名商标需要新思维

  据某国际权威机构的调查,中国产品的世界形象是:价格低廉,但产品质量差,当被问及产品打上中国品牌对销售的影响时,其结果竟是打上中国的品牌反而不利于产品的销售。我们的这些品牌已经被打上了中国的烙印,在目前国际上已经形成的对中国品牌的成见,如果我们还遵循这样一条路:商标先在国内注册,等在国内取得知名度后,再去国外注册,再将其培养成为一个国际驰名商标,这样艰难地去完成商标国际化几乎是行不通的。这样的现实情况下,我们的商标走出国门必然面临巨大的困难,那么要打造我国的国际驰名商标应当探寻其他途径,必须要有新的思维。

(一)走出去

  走出去政府也一直在提倡,关键在于怎么走出去?我们呼吁的是将商标注册走出去,为此政府对于在国外注册的商标还给予一些经费上的支持。商标走出去并不是目的,而只是一个手段而已,要将品牌在国外打响必须要将产品走出去。商标走出去只要注册即可,而要将产品走出去却非常的不容易,到现在为止我国企业能将产品走出去,并且其品牌在欧美市场叫得响的寥落星辰,屈指可数。我国企业将产品走出国门还有很多沟沟坎坎要过,很多学费要交。
  我国市场曾经有个“欧典”地板在短期迅速成名,其产品可以卖出很高的价格,因为消费者一直认为这是个国际驰名的品牌。尽管“欧典”地板被曝光是“假洋鬼子”,“欧典”也走出去了,但是目的是为了回来,在国内愚弄消费者。“欧典”这个商标迅速在国内驰名的方式还是值得我们深思,说明我国企业当务之急不是着急走出去,而是要先做好国内市场,在国内消费者心中树立良好的品牌形象,先在国内市场胜出国外品牌,练好内功才有能力走到国际市场与国外大品牌在国际市场同台共舞。
  笔者认为走出去主要是心态要走出“民族品牌”的狭隘观念,视野走出去,着眼的是国际大视野,胸中有乾坤,目标是将自己商标做出在国际都很驰名的商标,而不是局限在“中国驰名商标”上小富即安。不拘泥什么途径,不局限哪种方式,目的是巧妙规避一切障碍,抛开一起成见尽快将自己的商标在国际上打响。温州的“康奈”将企业开到了国外,“安信”地板则干脆放弃在国内相当成熟的品牌,专门为美国市场定制的“Ark”品牌,“Ark”出自Noah's Ark(诺亚方舟的意思),从人所共知的西方神话中取名,直接让品牌出生在国外,具有国际的血统。

(二)购买现成的商标,成名的捷径

  雷恰蒙特是欧洲市场顶级产品的供应商,拥有“江诗丹顿”、“伯爵”、“卡地亚”、“万宝龙”、“登
  喜路”等几十件历史悠久的世界一流商标。但这些商标都不是雷恰蒙特原创的,而是通过收购途径获得的。该公司总经理萨南曾说:“商标是一种竞争工具,收购商标就是收购市场。”成熟的品牌其价值还体现在现成的市场渠道,收购一个已有的品牌,加以改造,赋予其新内涵,可以利用其原有的渠道达到迅速成名的目的,大大缩短了品牌的培育时间以及经济成本。
  收购品牌其实就是借鸡生蛋,自创品牌的路更长,收购是一种又快又好的方式,我国的企业已经开始出手。卡丹路曾是意大利著名品牌,1989年进入中国,90年代一度号称中国第一品牌,但是后来经营不善,走向没落,几年前,孙××购买时只花了2000万元人民币,目前卡丹路品牌专卖店已经发展到1500家,遍布全国各大中城市。2008年金融危机使很多国家的经济遭受重创,一些国际知名的品牌不可避免受到冲击,我国企业想到去海外抄底购买世界级的知名品牌。2009年6月30日二十一世纪经济报道报道:温州人出手“皮尔卡丹”。温州商人孙××购买了皮尔卡丹全球华人区的商标权。四川的一家公司收购“悍马”品牌,吉利公司收购“沃尔沃”品牌,各种收购的故事层出不穷。收购品牌对我国企业而言不仅意味着收购到了市场,还有先进的品牌管理经验。将在国际上本来已经很驰名的商标直接收购,这是走了捷径。收购看起来简单,但是维持品牌的持续驰名对我国企业也将是个课题。

  总之打造国际驰名商标必须先要练好内功,具备基本的国际化能力。还要打开视野,具备国际化的胸襟,更需要国际化的思维能力,不拘泥任何固有的思维和运作模式,其后才能实现驰名商标中国造。

作者:王律师,中国知识产权研究会高级会员
电话:010-51662214,电邮:51662214@sohu.com




关于进境鸵鸟检疫有关问题的通知

动植物检疫局


关于进境鸵鸟检疫有关问题的通知

          (动植检动字〔1996〕87号)

 

各直属口岸动植物检疫局、动物检疫所:

  近年来,鸵鸟的引进和繁养在我国呈现了迅猛发展的势头,为满足引进鸵鸟及其种蛋的需要,一年多来,我们先后与美国、加拿大、法国、荷兰、津巴布韦、博茨瓦那、澳大利亚和纳米比亚签署了进境鸵鸟的检疫和卫生条件议定书,从而为引进鸵鸟在检疫方面铺平了道路。随着鸵鸟的大量引进,我们的检疫工作也日趋繁重,而鸵鸟的检疫在我国还是个崭新的课题,为总结近年来进境鸵鸟的检疫经验,进一步提高检疫水平,防止疫病随进口鸵鸟及其种蛋传入我国,使鸵鸟的检疫工作更加规范化和标准化,保证进境鸵鸟检疫工作的顺利进行,现就进境鸵鸟及其种蛋入境后的检疫工作的有关问题通知如下:

  一、进境鸵鸟检疫

  1.鸵鸟入境后须在口岸动植物检疫局指定的隔离场所进行为期45天的隔离检疫

,如须延长隔离检疫时间,须报国家局批准。

  2.鸵鸟运抵隔离场一周后,逐只进行采血采样,并分成两份,其中一份保存备

查,并注意编号。

  3.隔离检疫期间的实验室检疫项目,主要依照我国与输出国缔结的鸵鸟检疫议

定书规定的实验室检疫项目进行。如发生特种情况可做特殊检疫项目。

  4.实验室检疫的操作试行程序附后。

  二、进境鸵鸟种蛋检疫

  1.进境种蛋的孵化厂须获得口岸动植物检疫机关的认可。

  2.进境鸵鸟种蛋在入孵前,须用有效的消毒药进行熏蒸处理。

  3.进境种蛋不得与其他种蛋一同孵化。

  4.首次孵出的小鸟须在口岸动植物检疫机关认可的场所由口岸检疫机关隔离检

疫30天,在此期间采样并依照我国与输出国缔结的鸵鸟种蛋的检疫议定书规定的项目作实验室检疫。

  三、其他未尽事宜按《进境动物检疫管理办法》执行。

  四、在执行过程中有何问题,请及时上报国家局。

  附件:鸵鸟疫病实验室检疫操作试行规程

 

                       中华人民共和国动植物检疫局

                         一九九六年八月二十六日

         鸵鸟沙门氏菌泄殖腔拭子培养规程(试行)

 

  一、材料:

  灭菌棉拭子、缓冲蛋白胨水、亚硒盐胱氨酸增菌液、胆硫乳琼脂、三糖铁琼脂、生化试验管、多价血清因子、细菌培养必需设备。

  二、操作方法:用无菌棉拭子从泄殖腔取样,放无菌瓶中,尽可能冷藏于2~4℃,编号后送实验室检验。

  三、实验室检验:

        ┌────────┐

        │  棉拭子样品  │

        └─┬──────┘

          │

    ┌─────┴─────┐

    │   缓冲蛋白胨水   │

    └───┬───────┘

    37℃ │18 ̄24hr

     ┌──┴───────┐

     │ 亚硒盐胱胺酸增菌液 │

     └─┬────────┘

    37℃│ 18 ̄24hr

       │

   ┌───┴───┐

   │ DHL培养基 ├────────────────┐

   └─┬─────┘                │

  ┌──┴───────┐           ┌──┴────┐

  │挑取可疑菌落划线接种│           │  可疑菌落  │

  └────┬─────┘           └──┬────┘

       │                    │

   ┌───┴────┐               │

   │ 三糖铁培养基 │               │

   └──┬─────┘          ┌────┴──────┐

      │                │  革兰氏染色,镜检  │

  37℃ │ 18 ̄24hr          │           │

      │                └────────┬──┘

    ┌─┴──┐                      │

  ┌─┤细菌鉴定├───┐                  │

  │ └────┘   │                  │

  │          │                  │

 ┌┴───┐    ┌─┴──────┐           │

 │生化试验│    │  血清学试验  │           │

 └─┬──┘    └┬───────┘           │

   │       ┌┴─────┐             │

   └───────┤综合判定结果├─────────────┘

           └─┬────┘

           ┌─┴────────┐

           │  试验结果报告  │

           └──────────┘

 

        鸵鸟鹦鹉热间接血凝(IHA)操作规程(试行)

 

  一、本规程适用于鸵鸟衣原体病的诊断。

  二、材料

    衣原体属抗原致敏绵羊红细胞

    标准阴、阳性对照血清

    被检血清:采集鸵鸟血清,试验前于56℃水浴灭活30分钟。

    90度V型反应板

    灭菌生理盐水

    微量加样器

  三、试验方法

  1.将生理盐水滴于V型反应板中,每孔50ul。

  2.取被检血清50ul于第一孔中,与生理盐水混匀后吸50ul于第二孔,依次作倍

比稀释至1∶16。

  3.将1∶8和1∶16两孔各加25ul抗原,如作定量试验可根据实际需要自行决定。

  4.对照试验:设阳性血清+抗原、阴性血清+抗原、生理盐水+抗原各一孔。

  四、血凝反应程度的标准:

  “++++”:红细胞全部凝集,形成一层均匀的膜,布满整个孔底。

  “+++”:红细胞在孔底形成一层薄膜,面积比前者稍小。

  “++”:红细胞在孔底形成薄层凝集,边缘松散或呈锯齿状。

  “+”:红细胞在孔底呈稀薄、散在、少量凝集,孔底有小圆点。

  “+”:红细胞沉于孔底,但周围不光滑或中心有空斑。

  “—”:红细胞完全沉于孔底,呈光滑的圆点。

  “++”以上的凝集判为阳性凝集。

  五、结果判定

  1.对照试验:出现如下结果试验方可成立,否则应重试,阳性血清+抗原呈“

++++”;阴性血清十抗原呈“-”;抗原十生理盐水

  2.被检样品判定标准:血清效价>1∶8(++)判为阳性。

 

      鸵鸟新城疫、禽流感、付粘病毒分离操作规程(试行)

 

  本规程适用于新城疫、禽流感、付粘病毒的分离

  一、材料

  1.消毒棉拭子

  2.灭菌试管

  3.灭菌生理盐水

  4.泄殖腔棉拭子保存液:PBS,PH7.2-7.4,青霉素1万单位/ml,链霉素10mg/m1,庆大霉素250ug/ml,制霉素5000u/ml。

  5.SPF种蛋。

  6.90度V型反应板。

  7.微量加样器。

  二、操作方法

  1.将采集的泄殖腔棉拭子置于样品保存液中,置4℃过夜。次日3000rpm离心10min,上清液作菌检后接种9~10日龄鸡胚(每胚0.2ml),37℃再孵育5天,去掉24小时死亡的鸡胚,其他鸡胚放4℃冷却后,检测鸡胚尿囊液的血凝滴度。如尿囊液

的血凝反应呈阴性,应再用鸡胚盲传2代。

  2.将收集的尿囊液用PBS以25ul量进行倍比稀释,加25ul的1%鸡红细胞,轻轻

混匀,静置15~30min,判定血凝滴度。

  如鸡胚尿囊液的血凝试验呈阳性,应分别用新城疫病毒、禽流感病毒、副粘病毒的阳性血清作血凝抑制试验以检测病毒的种类。

 

表一 鸡胚尿囊液血凝试验 (单位:ul)

 

┌─────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬───┬────┐

│ 孔号  │  1  │  2  │  3  │  4  │  5  │  6  │  7  │  8  │  9  │  10 │  11│  12 │

├─────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼───┼────┤

│抗原稀释度│ 1∶2 │ 1∶4 │ 1∶8 │1∶16  │1∶32  │ 1∶64 │ 1∶128│ 1∶256│ 1∶512│1∶1024 │对照 │对照  │

├─────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼───┼────┤

│ 生理盐水│  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  50│  50 │

├─────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼───┼────┤

│ 抗原  │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │   │    │

├─────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼───┼────┤

│1%红细胞 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25 │  25│  25 │

└─────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴───┴────┘

  室温15min,每5mim观察一次                    

┌─────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬───┬────┐

│ 判定举例│++++  │++++  │++++  │+++   │  ++  │ -   │  -  │   - │  -  │  -  │  - │  -  │

└─────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴───┴────┘


          禽流感血凝抑制试验操作程序(试行)

 

  一、试验材料

  1.抗原:禽流感病素H5、H7型抗原;

  2.阴、阳性对照血清。

  3.红细胞:无菌采集鸡血液5~10ml于少许阿氏液中摇匀,以洗涤3~5次,每次3000rpm离心10min,将血浆、白细胞充分洗去至上清液清亮,再将沉淀的红细胞稀释成1%的红细胞悬浮液(RBC);

  4.被检血清:采集被检鸵鸟血液,离心分离血清,56℃灭活30min;

  5.稀释液:灭菌的生理盐水或PBS(pH7.2~7.4)

  6.90度V型反应板,微量加样器。

  二、试验操作

  1.血凝试验(HA):

  取干净的微量滴定板(V型)一块,按表一进行操作:每孔加25ul生理盐水,孔

1加禽流感抗原25ul,用移液器反复吹打混匀三次;吸出25ul于孔2,吹打混匀后吸出25ul于孔3;如此依次稀释到孔10,孔10混匀后吸出25ul弃掉。孔11、12不加抗原

,只加生理盐水作空白对照。加入1%的红细胞悬浮液25ul,充分振荡后置于室温;

每5min观察一次,15~30min后判定结果,并作好记录。

 

表一 禽流感血凝试验 (单位:ul)

 

┌─────┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬────┬────┬────┬────┬───┬───┐

│ 孔号  │  1 │  2 │  3 │  4 │  5 │  6 │  7  │  8  │  9  │  10 │  11│  12│

├─────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤

│抗原稀释度│ 1∶2│ 1∶4│ 1∶8│1∶16 │1∶32 │1∶64 │ 1∶128│ 1∶256│ 1∶512│1∶1024 │对照 │对照 │

├─────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤

│生理盐水 │  25│  25│  25│  25│  25│  25│  25 │  25 │  25 │  25 │  50│  50│

├─────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤

│ 抗原  │  25│  25│  25│  25│  25│  25│  25 │  25 │  25 │  25 │   │   │

├─────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤

│1%红细胞 │  25│  25│  25│  25│  25│  25│  25 │  25 │  25 │  25 │  25│  25│

└─────┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴────┴────┴────┴────┴───┴───┘

  室温15min,每5min观察一次            

┌─────┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬────┬────┬────┬────┬───┬───┐

│ 判定举例│  + │  + │ +  │ +  │ +  │ +  │  +  │  -  │  -  │  -  │  - │  - │

└─────┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴────┴────┴────┴────┴───┴───┘


  抗原的血凝滴度是凡能使1%的鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数;因此,

能使红细胞完全凝集的最高稀释倍数的病毒液25ul称为1个血凝单位(HA)。如该抗

原的血凝单位为1∶128/25ul。

  在进行禽流感血凝抑制试验时,病毒的工作浓度应为8HA。因为该试验的抗原的

血凝单位为1∶128/25ul,按其孔号数(孔.7)倒退3孔的稀释倍数(孔4 1∶16)

,作为该病毒的工作浓度:1∶16/25ul。

  2.血凝抑制试验(HI):

  取干净的微量滴定板(V型)一块,按表二进行操作:每孔加25ul生理盐水,孔

1加待检血清25ul,用移液器反复吹打混匀三次;吸出25ul于孔2,吹打混匀后吸出25ul于孔3;如此依次稀释到孔8,孔8混匀后吸出25ul弃掉。孔9作为阳性血清对照,孔10作为阴性血清对照,孔11不加任何血清而作为抗原对照,孔12不加抗原和任何血清,只加PBS作空白对照。各孔加入1%的红细胞悬浮液25ul,充分振荡后置于室温;每5min观察一次,15~30min后判定结果,并作好记录。

  未免疫的健康鸵鸟血清无血凝抑制作用,各稀释倍数均出现红细胞凝集现象;禽流感感染或免疫的鸵鸟血清能抑制禽流感病毒对红细胞的凝集作用。凡能使8HA的

抗原凝集红细胞作用完全抑制的血清最高稀释倍数,称为该血清的血凝抑制价(如表二的血凝抑制价为1∶64)。

 

表二 禽流感血凝抑制试验 (单位:ul)

 

┌──────┬───┬───┬───┬────┬────┬───┬────┬────┬────┬────┬───┬───┐

│ 孔号   │  1 │  2 │  3 │  4  │  5  │  6 │  7  │  8  │  9  │  10 │  11│  12│

├──────┼───┼───┼───┼────┼────┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤

│血清稀释度 │ 1∶2│ 1∶4│ 1∶8│ 1∶16 │ 1∶32 │1∶64 │ 1∶128│ 1∶256│ 阳性 │ 阴性 │抗原 │对照 │

├──────┼───┼───┼───┼────┼────┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤

│ 生理盐水 │  25│  25│  25│  25 │  25 │  25│  25 │  25 │  25 │  25 │  50│  75│

├──────┼───┼───┼───┼────┼────┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤

│ 被检血清 │  25│  25│  25│  25 │  25 │  25│  25 │  25 │  (25)│  (25)│   │   │

├──────┼───┼───┼───┼────┼────┼───┼────┼────┼────┼────┼───┼───┤

│ 8HA抗原  │  25│  25│  25│  25 │  25 │  25│  25 │  25 │  25 │  25 │  25│   │

└──────┴───┴───┴───┴────┴────┴───┴────┴────┴────┴────┴───┴───┘

  室温感作5~6min                                           

┌──────┬───┬───┬───┬────┬────┬───┬────┬────┬────┬────┬───┬───┐

│ 1%红细胞 │  25│  25│  25│  25 │  25 │  25│  25 │  25 │  25 │  25 │  25│  25│

└──────┴───┴───┴───┴────┴────┴───┴────┴────┴────┴────┴───┴───┘

  室温15min,每5min观察一次                                      

┌──────┬───┬───┬───┬────┬────┬───┬────┬────┬────┬────┬───┬───┐

│ 判定举例 │  - │  - │  - │  -  │  -  │ +  │  +  │  +  │  +  │  +  │  + │  + │

└──────┴───┴───┴───┴────┴────┴───┴────┴────┴────┴────┴───┴───┘


  3.判定标准

  1)判定时应首先观察各对照孔是否完全符合;

  2)红细胞凝集:红细胞分散在孔底四周呈均匀的颗粒状凝集且布满整个孔底,

判为血凝作用为阳性“十”;

  3)无凝集或凝集抑制:红细胞集中于孔底中央呈点状,判血凝作用为阴性“—

”,或判血凝抑制作用为阳性;

  4)血凝抑制价:凡能使抗原的血凝作用完全受到抑制的最高血清稀释倍数;

  5)被检血清的血凝抑制价在1∶8以上者,判为阳性反应;

  6)最后判定时间与感作时间有关。温度高时感作时间短,15min即可;温度低时可适当延长,但最长不得超过30min。

 

          禽流感琼脂扩散试验操作规程(试行)

 

  1.琼脂凝胶平板的制备:称取琼脂糖1g,氯化钠8.5g,加入100ml蒸馏水,10磅10分钟高压溶解后,冷却至45℃,加入0.01%叠氮钠,每个直径6CM平皿加7ml融化琼脂,厚度为2.8mm,待凝固后置冰箱内片刻。

  2.打孔:中间一孔,周围六孔为一组,孔径3mm,孔居2.5mm。

  3.加样:中心孔加抗原,周围1、3、5孔加阳性血清,2、4、6孔加被检血清。

  4.加样后置湿盒内,于室温下感作。

  5.结果判定:24小时初判,48小时终判,阳性对照成立时,进行判定。

  阳性:被检血清孔与抗原孔之间出现致密沉淀线,并与标准阳性血清的沉淀线末端互相联接。

  可疑:标准阳性血清孔和抗原孔之间的沉淀线向被检血清孔内侧弯曲。

  阴性:抗原孔与被检血清孔之间不出现沉淀线或标准阳性血清与阳性孔间的沉淀线向毗邻的被检血清孔直伸或其外侧偏弯。

 

           禽副粘病毒血凝抑制试验操作程序

 

  一、试验材料

  1.抗原:禽副粘病毒病毒Ⅱ型抗原;

  2.红细胞:无菌采集鸡血液5~10ml于少许阿氏液中摇匀,以洗涤3~5次,每次3000离心10min,将血浆、白细胞充分洗去至上清液清亮,再将沉淀的红细胞稀释

成1%的红细胞悬浮液(RBC);

  3.被检血清:采集被检鸵鸟血液,离心分离血清,56℃灭活30min;

  4.稀释液:灭菌的生理盐水或PBS(pH7.2~7.4)

  5.阴、阳性对照血清

  6.90度V型反应板,微量加样器。

  二、试验操作

  1.血凝试验(HA):

  取干净的微量滴定板(V型)一块,按表一进行操作:每孔加25ul生理盐水,孔

1加禽流感抗原25ul,用移液器反复吹打混匀三次;吸出25ul于孔2,吹打混匀后吸出25ul于孔3;如此依次稀释到孔10,孔10混匀后吸出25ul弃掉。孔11、12不加抗原

,只加生理盐水作空白对照。加入1%的红细胞悬浮液25ul,充分振荡后置于室温;

每5min观察一次,15~30min后判定结果,并作好记录。

 

表一 禽副粘病毒血凝试验   (单位:ul)

 

┌──────┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬────┬────┬────┬─────┬───┬───┐

│ 孔号   │  1 │  2 │  3 │  4 │  5 │  6 │  7  │  8  │  9  │  10  │  11│  12│

├──────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼─────┼───┼───┤

│抗原稀释度 │ 1∶2│ 1∶4│ 1∶8│1∶16 │1∶32 │1∶64 │ 1∶128│ 1∶256│ 1∶512│ 1∶1024 │对照 │对照 │

├──────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼─────┼───┼───┤

│ 生理盐水 │  25│  25│  25│  25│  25│  25│  25 │  25 │  25 │  25  │  50│  50│

├──────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼─────┼───┼───┤

│ 抗原   │  25│  25│  25│  25│  25│  25│  25 │  25 │  25 │  25  │   │   │

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